CRISPR-на-чіпі для діагностики раку

CRISPR-на-чіпі для діагностики раку

CRISPR (англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) – розмірені міжрядкові короткі паліндромічні (що читаються однаково в обох напрямках) повторення послідовностей ДНК захисного механізму прокаріотів. Методика CRISPR-Cas для спрямованого редагування геномів є перспективним напрямком в сучасній генній інженерії.

CRISPR-на-чіпі для діагностики раку
Діаграма можливого механізму CRISPR

CRISPR з незрозумілої частини бактеріальної захисної імунної системи виріс в інструмент для лікування генетичних захворювань, поліпшення виробництва їжі і знищення шкідників. З тих пір, як вчені взяли на озброєння цей інструмент для редагування генів і почали використовувати його на клітинах ссавців, CRISPR був забарикадований за клітинними мембранами. Технологія редагування генів творить свою магію, відрізаючи шматочки несправної ДНК і вставляючи здорову заміну. Всі ці дії з вирізання та вставляння сегментів відбувалися в живих клітинах.

Минулого тижня в журналі CRISPR Journal було опубліковано дослідження, що нарешті звільнило CRISPR з його клітинної в’язниці. Замінивши компоненту «ножиць» CRISPR альтернативною версією, вчені з Інституту редагування генів в Делавері розробили нову систему CRISPR, яка може різати вільно плаваючу в пробірці ДНК.

Для допомоги в проведенні реакцій пробірка заповнюється клітинними екстрактами: набором ферментів та інших біомолекул, необхідних для роботи CRISPR. Цей інструмент дозволяє вченим одночасно робити кілька генетичних врізок, в той час як попередні версії були обмежені редагуванням ДНК в межах одного гена. Це чудові новини для персоналізованої медицини, особливо для діагностики раку. Багато видів раку на лікування відповідають по-різному, мають мутації в декількох місцях. Перед початком лікування лікарі часто відправляють біопсійний зразок пухлини пацієнта на секвенування ДНК (техніка визначення амінокислотної або нуклеотидної послідовності в ДНК і РНК). Цей важливий крок допомагає виявити безліч генетичних мутацій, які можуть привезти до розростання конкретної пухлини.

За допомогою нового інструменту вчені можуть точно імітувати ці мутації в синтетичних фрагментах ДНК в пробірці, по суті відтворюючи рак в безпечному, контрольованому середовищі. Це дає вченим доступ до біологічних шляхів, порушених мутаціями, і може допомогти в створенні персоналізованої стратегії лікування.

Вражає, що такого роду діагностику можна провести всього за один день. «Це особливо важливо для діагностики, пов’язаної з раком, коли іноді рахунок йде на хвилини або години», – говорить автор дослідження доктор Ерік Кмієць.

Кміець не був першим, хто побачив в CRISPR інструмент діагностики. Раніше було відомо, що дві групи вчених представили тести DETECTR і SHERLOCK, які ефективно полюють на віруси Зика, денге і небезпечні штами ВПЛ, що призводять до раку шийки матки.

Кмієць стверджує, що його винахід вимагає значно менше часу, щоб підтвердити рак поза тілом, в основному через здатність вносити кілька редакцій одночасно.

Усвідомивши потенціал і рентабельність CRISPR як діагностичного інструменту, Кмієць і його колеги вже шукають комерційного партнера для розробки технологіх «CRISPR-на-чіпі» для діагностики раку.

Якщо відкласти в сторону безпосередні додатки, команда вчених також планує застосовувати терапевтичні можливості CRISPR до більш широкого спектру захворювань. Існуючі інструменти CRISPR ідеально підходять для лікування хвороб, що викликані мутаціями в одному гені, таких як серповидноклітинна анемія або хвороба Хантінгтона. Але оскільки робота Кмієця націлена на кілька генів одночасно, це дає можливість в перспективі застосовувати її для лікування хвороб з більш складним генетичним походженням – множинних мутацій в безлічі генів, якщо ці мутації добре охарактеризовані.

Ізоляція CRISPR в пробірці має й інший плюс: вона дозволяє вченим чітко зрозуміти, що відбувається до, під час і після редагування. Оскільки клінічні випробування CRISPR активно просуваються, важливо зрозуміти, як зробити технологію більш точною і ефективною. Незручна правда полягає в тому, що вчені поки не зовсім впевнені, як інструмент працює, потрапляючи в клітину. Як інструменти взаємодіють з іншими біокомпонентами в клітці? Чи відтинає він тільки цільову ДНК або ж при певних обставинах його «ножиці» можуть піти в рознос?

«Коли ви працюєте з CRISPR в середині клітини, ви працюєте в чорному ящику, в якому не можете спостерігати за механізмами, – говорить Кмієць. – Ви можете бачити результати, тобто зміни генів, але не як ви до цього прийшли. А це, щоб переконатися в безпеці CRISPR, є важливим при лікуванні пацієнтів».

Обмежуючи CRISPR серією біохімічних реакцій в тестовій пробірці, вчені пропонують спосіб розглянути складні молекулярні взаємодії, які проходять під час розрізу ДНК, заміни генів і інших процесів. Підхід – виключно редукціоністський. Але він дозволяє безклітинній системі працювати подібно Arduino, експериментувати з можливостями CRISPR і створювати нові біологічні інструменти, які й уявити важко.

CRISPR-на-чіпі для діагностики раку
Механізм CRISPR Cas9

Інститут редагування генів, розробляючи свою безклітинну систему, практично відразу зіткнувся з проблемою.

Проблемою  виявився Cas9, білок «ножиць», який використовується в системах CRISPR. Коли вчені замішали його з плазмідною ДНК (типом циркулярної ДНК, яку вчені часто використовують для доставки генів у клітини) в пробірці, білок був абсолютно неактивний.

З’ясувалося, що Cas9 потрібно замінити на Cpf1 (він же Cas12a), інший член зростаючої бібліотеки Cas-білків. Вперше відкритий в 2015 році, Cpf1 вже довів свою користь у створенні трансгенних мишей і коригування мутації, що викликає м’язову дистрофію. Не так давно Cpf1 використовувався в системі DETECTR для боротьби з вірусами, що викликають рак. У цього білка світле майбутнє: компанія Editas, що редагує гени, ліцензувала його для подальшої розробки в 2016 році.

Обмін спрацював. Система CRISPR-Cpf1 прийшла в дію в тестовій пробірці. В ході декількох експериментів вчені довели, що вільна від клітини система може повторити більшість редакцій, які CRISPR вносить всередині клітини. Що примітно, «ножиці» спрацювали трохи не так, як у Cas9. Коли Cas9 робить розріз, він залишає гладкими «обрублені кінці» на розрізаній ДНК. Це ускладнює введення нових шматочків генетичного матеріалу. Оскільки кінці дуже гладкі, інструментарій вимагає точного вирівнювання замінного блоку ДНК, щоб він ковзнув на місце.

І навпаки, Cpf1 залишає «липкі» кінці. Ці шматочки ДНК виступають як плечі, що підтримують немов скотч захоплення замінної ДНК. Можливо, саме тому Cpf1 працює краще, ніж Cas9, в пробірці, але це належить ще перевірити.

Система Кмієця – лише один із прикладів того, як далеко просунувся CRISPR. Оскільки CRISPR продовжує рости, його розробники обіцяють ще багато нового і цікавого.

Be the first to comment

Leave a Reply

Your email address will not be published.


*