ДНК-мікрочіп

ДНК-мікрочіп
Геном людини (ліворуч) і миші (праворуч) на ДНК-мікрочіпах

ДНК або дезоксирибонуклеїнова кислота – одна з трьох основних макромолекул організму (дві інші – РНК і білки), яка забезпечує зберігання, передачу інформації з покоління в покоління і реалізацію генетичної програми розвитку і функціонування живих організмів. Молекула ДНК зберігає біологічну інформацію у вигляді генетичного коду, що складається з послідовності нуклеотидів. ДНК містить інформацію про структуру різних видів РНК і білків.

ДНК у клітинах еукаріотів (тварин, рослин і грибів) знаходиться в ядрі клітини в складі хромосом, а також в деяких клітинних органелах (мітохондріях і пластидах). У клітинах прокаріотів (бактерій і архей) кільцева або лінійна молекула ДНК, так званий нуклеоїд, прикріплена зсередини до мембрани клітини. У них і у нижчих еукаріотів (наприклад, дріжджів) зустрічаються також невеликі автономні кільцеві молекули ДНК, так звані плазміди. Крім того, одно- або дволанцюгові молекули ДНК можуть утворювати геном ДНК-вірусів.

З хімічної точки зору ДНК – це довга полімерна молекула, яка складається з послідовності блоків – нуклеотидів. Нуклеотид складається з азотистої основи, цукру (дезоксирибози) і фосфатної групи. Зв’язки між нуклеотидами в ланцюжку утворюються за рахунок дезоксирибози і фосфатної групи (фосфодіефірні зв’язки). У переважній більшості випадків (крім деяких вірусів, що містять одноланцюгові ДНК) макромолекула ДНК складається з двох ланцюжків, орієнтованих азотистими основами. Ця дволанцюгова молекула закручена по гвинтовій лінії. Гвинтова лінія може бути правою (A- і B-форми ДНК) або лівої (Z-форма ДНК).

ДНК-мікрочіп
Структури основ у складі ДНК

Азотисті основи (аденін (A), гуанін (G), тимін (T) і цитозин (C)) одного з ланцюжків сполучаються з азотистими основами іншого ланцюжка водневими зв’язками за принципом комплементарності: аденін (A) з’єднується тільки з тиміном (T), гуанін (G) – тільки з цитозином (C). Як виняток, наприклад, у бактеріофага PBS1 в ДНК зустрічається п’ятий тип основ – урацил ([U]), піримідинову основу, що відрізняється від тиміну відсутністю метильної групи на кільці, зазвичай в РНК замінює тимін. Слід зазначити, що після синтезу деяких молекул РНК значне число урацилів в транспортних і рибосомних РНК метилірується за допомогою спеціальних ферментів, перетворюючись на тимін.

Послідовність нуклеотидів дозволяє «кодувати» інформацію про різні типи РНК, найбільш важливими з яких є інформаційні або матричні (мРНК), рибосомальні (рРНК) і транспортні (тРНК). Всі ці типи РНК синтезуються на матриці ДНК за рахунок копіювання послідовності ДНК в послідовність РНК, що синтезується в процесі транскрипції, і беруть участь в біосинтезі білків (процесі трансляції). Також ДНК клітин містить послідовності, що виконують регуляторні і структурні функції. Але в геномі еукаріотів іноді зустрічаються ділянки, що належать «генетичним паразитам», наприклад, транспозони.

Комплементарна ДНК (кДНК, англ. СDNA) – це ДНК, синтезована на матриці зрілої мРНК в реакції, що каталізується зворотньою транскриптазою. кДНК часто використовується для клонування генів еукаріотів в прокаріотах.

Мікрочіп (chip – тонка пластинка) – мікропристрій з електронною схемою довільної складності (кристал), яка виготовлена ​​на напівпровідниковій підкладці (пластині або плівці). ДНК-мікрочіп складається з безлічі невеликих одноланцюгових молекул – ДНК-зондів, які ковалентно пришиті до твердої основи. Кожен такий зонд має певну послідовність нуклеотидів і місце на мікрочіпі. ДНК-мікрочіп (DNA microarray) – технологія, яка використовується в молекулярній біології та медицині.

Однакові зонди розташовуються разом, утворюючи сайт мікрочіпа. Між сайтом і послідовністю ДНК зонда є взаємно-однозначна відповідність. ДНК-мікрочіпи, зазвичай після зворотної транскрипції, використовуються для визначення структури ДНК або РНК. Експресія генів – це процес, в ході якого спадкова інформація від гена перетворюється в функціональний продукт – РНК або білок.

Вимірювання генної експресії за допомогою кДНК називається профілем експресії, або експресійним аналізом. На сучасних мікрочіпах можна повністю розмістити цілий геном, кожен відомий ген якого буде зондом.

ДНК-мікрочіп
Комплементарні ДНК утворюють дуплекс, який при неповній компліментарності виходить значно слабшим і може бути змитий з чіпа. «Хороший» дуплекс буде давати сигнал, в даному випадку у вигляді світла

В основі роботи ДНК-мікрочіпів лежить явище гібридизації. При наявності невеликих кількостей ДНК досліджуваного зразка здійснюють ампліфікацію (процес утворення додаткових копій ділянок хромосомної ДНК). Для РНК спочатку здійснюється зворотна транскрипція, що втім не обов’язково: існують чіпи, які працюють як з ДНК, так і з РНК. Перевірка зразків ДНК / РНК полягає в міченні зразків різними флуоресцентними мітками для подальшого виявлення і нанесення зразків на мікрочіп. ДНК-мікрочіп з нанесеним на нього зразком деякий час інкубують, щоб відбулася гібридизація комплементарних одноланцюгових молекул, після чого чіп промивають. Всі некомплементарні ДНК/РНК зразка змиваються з чіпа. Після цього проводять сканування мікрочіпа за допомогою лазера, який викликає флуоресценцію мічених молекул зразка. Підключений до комп’ютера мікроскоп оцінює флуоресценцію кожного сайту ДНК-мікрочіпа, тобто визначає послідовності гібридизації ДНК, що дозволяє встановити послідовність ДНК/РНК зразка.

Технологія ДНК-мікрочіпів бере свій початок від методики Саузерн-блот, в якій фрагментовану ДНК переносять на відповідний носій і потім за допомогою зонда з відомою нуклеотидною послідовністю визначають зміст цільової послідовності зразка.

Вперше набір різних ДНК, об’єднаних в чіп, був використаний в 1987 році для визначення особливостей регуляції експресії генів інтерферонами. Ранні ДНК-мікрочіпи були зроблені шляхом «розкопування» кДНК на фільтрувальний папір. Використання мініатюрних чіпів для визначення особливостей експресії генів було здійснено в 1995 році, а повний еукаріотичний геном (Saccharomyces cerevisiae) було розміщено на мікрочіпі в 1997 році.

ДНК-мікрочіп
Схема процесу складання ДНК-мікрочіпа за допомогою фотолітографії

Ампліфіковані фрагменти ДНК за допомогою мікроманіпулятора наносяться на кремнієві або скляні пластини, ковалентно закріплюючи зонди. У 1991-1993 роках був запропонований інший підхід, в основі якого лежала технологія фотолітографії, яка використовується в напівпровідниковій індустрії. Пізніше, в 1997 році, був запатентований метод електрофокусування.

Збірка починається з нанесення на скляну пластинку розміром 12,8 × 12,8 мм спеціального захисного фоточуттєвого шару, який робить саму платівку інертною. Тільки ті місця, де захисний шар буде освітлений, здатні приєднати дезоксирибонуклеотиди (A, T, G, C). Після впливу світла на пластинку наноситься розчин одної із основ. Всі інші місця захищені спеціальною фотолітографічною маскою. Таким чином дезоксирибонуклеотиди ковалентно приєднуються до пластинки в точно потрібних місцях, після чого все, що не змогло зв’язатися – змивається. Самі нуклеотиди хімічно модифіковані так, щоб вони могли зв’язати інший нуклеотид тільки під впливом світла. Багаторазово повторюючи цикли маски – освітлення – нанесення нуклеотиду – промивання стільки разів скільки необхідно і постійно змінюючи маски можна домогтися створення унікальних послідовностей. Для створення чіпа, відповідно до вимог до отримуваних зондів, розробляють різні маски.

Ланцюги однакової одноланцюгової ДНК, які організовані в квадрат 90х90 мкм, ростуть на поверхні пластини нуклеотид за нуклеотидом. Кожен квадрат в результаті містить мільярди ідентичних зондів. Сьогодні фотолітографію використовують для створення відносно коротких зондів, довжиною не більше 100 нуклеотидів. При цьому кількість масок, змінюваних за час складання такого чіпа, можна порівняти з довжиною зондів: так, для збірки зондів довжиною 18-25 нуклеотидів на чіпі буде потрібно близько 40 масок. На практиці велику кількість ідентичних ДНК-мікрочіпів виготовляють разом на великій скляній підкладці.

ДНК-мікрочіп
Підкладка для ДНК-мікрочіпа, яка використовується при методі електричного фокусування

Електрофокусування. Збірка такого роду мікрочіпів вимагає особливо складних підкладок, що по суті представляють собою електронні чіпи з безліччю виходів, кожен з яких контролює напругу на певному місці пластинки. На відміну від фотолітографії, де зонди збираються основою за основою, в електрофокусуванні вже готові одноланцюжні олігонуклеотиди доставляються до потрібних місць пластинки під дією електричного поля. У потрібному місці пластинки за допомогою відповідного виходу мікрочіпа створюється позитивна напруга. Негативно заряджена одноланцюгова ДНК рухається до створеного позитивного заряду і прикріплюється в потрібному місці. Після цього активується наступний вихід мікрочіпа, даючи позитивний заряд в іншому місці пластинки, куди і спрямовується наступний зонд. Щільність розташування ДНК на такого роду чіпах набагато менша ніж на чіпах, отриманих за допомогою фотолітографії.

Існує три базових типи мікрочіпів:
– для аналізу генної експресії (GEM-microarray),
– для порівняльної геномної гібридизації (MCGH),
– для виявлення поодиноких нуклеотидних поліморфізмів (SNPM).

Базовий протокол може бути представлений наступними процесами:

  1. Виділення ДНК / РНК. На цьому етапі виділяється або мРНК (GEM), або фрагменти геномної ДНК (MCGH, SNPM).
  2. Мічення ДНК / РНК. Цей процес починається зі зворотної транскрипції. Потім проводять ампліфікацію цільового фрагмента за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, в процесі якої до складу фрагментів ДНК включаються нуклеотиди з флуоресцентними мітками.
  3. Гібридизація. Тут флуоресцентномічені ампліфіковані зразки використовуються як мішені, для пошуку на мікрочіпі комплементарних ланцюгів, тобто здатних утворювати міцні подвійні ланцюги – дуплекси, за правилом комплементарності. Як приклад, комплементарні послідовності 5′-GCATGCAT-3 ‘і 3’ CGTACGTA-5 ‘. Якщо один з ланцюгів утвореного дуплексу мічений, то сигнал від такого дуплексу можна зареєструвати.
  4. Промивання. Як тільки закінчується гібридизація, чіп виймають з розчину, що містить зразки міченої ДНК. Після чого сам чіп ретельно промивають за певними методиками, використовуючи різні буферні суміші, центрифугування і т.д.
  5. Сканування. Цей процес передбачає використання оптичних сканерів, здатних детектувати фотони з певною довжиною хвилі. Кожен сайт чіпа висвітлюється пучком світла певної довжини хвилі, що активує флуоресцентну мітку. Мікрочіп просвічують аргоновими лампами. Активована флуоресцентна мітка випускає фотон з хвилею трохи більшої довжини, що реєструє прилад. Чим більше фотонів при одному засвітленні зловить прилад, тим вище інтенсивність світіння даної точки.
  6. Аналіз даних. Дані – масив значень інтенсивності світіння кожного конкретного сайту мікрочіпа. Використовуючи найрізноманітніші математичні методи порівняння, можна достовірно встановити сайти чіпа, де пройшла гібридизація, а значить і дізнатися послідовність ДНК \ РНК зразка.

Області застосування

Аналіз експресії генів – це переважне застосування ДНК-мікрочіпів. РНК, виділена з культури клітин, піддається зворотній транскрипції, в результаті якої виходить мічена кДНК. Іноді потрібен ще один етап транскрипції з кДНК (для чіпів, які працюють з РНК). Тоді виходить мічена кРНК. Існує декілька різних способів внесення в цільову молекулу різних міток: включення флуоресцентно-мічених нуклеотидів в процесі синтезу кДНК або кРНК, використання біотин-модифікованих нуклеотидів, які потім забарвлюються флуоресцентно-міченим стрептавідином, використання під час синтезу модифікованих нуклеотидів, на які потім можна додати флуоресцентну мітку.

Мічена таким чином ДНК або РНК гибрідизується на мікрочіпі, після чого змивається. В кожній точці чіпа детектується флуоресцентний сигнал. У випадку з біотинильованими зразками, ДНК-мікрочіп після гібридизації забарвлюється стрептавідином, що містить флуоресцентні мітки. Флуоресценція збуджується світлом лазера і, як правило, реєструється конфокальним мікроскопом.

Аналіз зв’язування транскрипційних факторів. Для визначення сайтів зв’язування транскрипційних факторів (ТФ) мікрочіпи також використовуються разом з імунною преципітацією хроматину. У екстракт клітинної ДНК додають формальдегід, що веде до утворення ковалентних зшивок між ДНК і білками. Після чого ДНК фрагментується. Потрібний ТФ виділяється з суміші за допомогою афінної хроматографії з використанням антитіл або тегів, котрі генно-інженерними методами вставляються в даний ТФ заздалегідь. Після очищення ДНК звільняється від ТФ, ампліфікується, позначається флуоресцентно і використовується для гібридизації на мікрочіпі. Така техніка широко відома як «ChIP-chip» або іммунопреципітація хроматину на мікрочіпі. Але в зв’язку з тим, що ТФ можуть зв’язуватися далеко від регульованого ними гена, у такої техніки є свої обмеження.

ДНК-мікрочіп
Виявлення SNPs. A) аллельна дискримінація. Б) «Golden Gate» аналіз. В) Розширення праймерів. Г) Аналіз крайньої межі

Генотипування. ДНК-мікрочіпи широко використовуються для виявлення однонуклеотидних поліморфізмів (SNP). Існує кілька різних підходів:

  • алельна дискримінація – на мікрочіпах розташовуються короткі зонди (25 нуклеотидів для мікрочіпів Affymetrix), що містять всі варіанти SNP в центрі, така позиція найбільш сильно впливає на якість гібридизації. Фрагментована, ампліфіккована, флуоресцентно-мічена ДНК зразка наноситься на мікрочіп, де відбувається гібридизація зразка і зонда. Найкращий сигнал буде виникати там, де мала місце повна компліментарність молекул;
  • «Golden Gate» аналіз – в основі методу лежить полімеразна ланцюгова реакція. У розчин геномної ДНК поміщаються молекули комплементарні геномній ДНК і на 3′-кінці містять різні модифікації SNP, а на 5′-кінці різні праймери (короткий фрагмент нуклеїнової кислоти або олігонуклеотид) для подальшого проведення ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції), крім того додається і комплементарна (інший ланцюг геномної ДНК) молекула з іншого боку від SNP, що містить на 5′-кінці ще один праймер для ПЛР. Полімераза буде здійснювати синтез тільки з того праймера, 3′-кінець якого відповідає SNP. У підсумку, в залежності від того, з якого праймера з видозміненим 3′-кінцем буде йти ПЛР, такий SNP і буде спостерігатися в зразку;
  • розширення праймерів – в цьому випадку зонди підібрані так, що покривають всю ділянку ДНК прямо до SNP, не включаючи поліморфізм. Фрагментована геномна ДНК гібридизується з таким чіпом, після чого в розчин додається полімераза і флуоресцентно-мічені нуклеотиди з 4 різними мітками на 3′-кінці. Подібні нуклеотиди можуть приєднатися полімеразою до вже наявного ланцюга, але потім приєднати до себе наступний нуклеотид не можуть. В результаті зонди розширюються на один нуклеотид, який і відповідає SNP;
  • оцінка крайнього нуклеотиду – цей метод дуже схожий з методом розширення праймерів. Єдина відмінність полягає в тому, що зонди розташовуються не на плоскій підкладці, а на безлічі дрібних кульок. SNP також розпізнається за кольором мітки єдиного добудованого нуклеотиду.

Обмеження. Незважаючи на достоїнства ДНК-мікрочіпів, у них є і обмеження у застосуванні. Передбачається, що інтенсивність сигналу (світіння), зареєстрована в конкретному сайті мікрочіпа, лінійно залежить від кількості ДНК, яка пройшла гібридизацію. Але насправді це далеко не завжди так: через кінетику гібридизації рівень сигналу, отриманий в даній точці, не є лінійною функцією від концентрації даної ДНК зразка. Таким чином, точно оцінювати кількість ДНК зразка можна лише при деяких початкових концентраціях ДНК, які, все ж, можуть забезпечити лінійну залежність. Оцінка щодо великих чи малих концентрацій ДНК зразка спочатку буде неточною.

У складних геномах еукаріотів, особливо ссавців, зустрічається безліч гомологічних генів, послідовності яких дуже схожі, що накладає додаткові умови на дизайн зондів для мікрочіпів. Зонд, сконструйований для одного гена A, може також «зловити на себе» ще й гени B, C, D, які є гомологічними гену A, що буде спотворювати підсумкову картину.

Ще одне обмеження пов’язане з тим, наскільки великою на даний момент в розпорядженні людства є база генів. Якщо не показане існування якогось гена, то і неможливий синтез відповідного зонда, який буде розташовуватися на мікрочіпі. І ніякі взаємодії таких генів не можуть бути виявлені. Особливо актуальна ця проблема для прокаріотів: геноми навіть близькоспоріднених організмів можуть значно відрізнятися. Наприклад, у бактерій виду Aggregatibacter actinomycetemcomitans геноми різних штамів можуть відрізнятися на 20% генів, і тому мікрочіпи, сконструйовані під один штам, не зможуть виявити інший.

Be the first to comment

Leave a Reply

Your email address will not be published.


*