Міжвидова комплементація бластоцист in vivo для трансплантації

Міжвидова комплементація бластоцист in vivo для трансплантації

Найпростіший з методів клітинної терапії полягає в трансплантації суспензії диференційованих клітин для заміщення дефектної клітинної популяції в конкретному органі. Цей підхід можуть застосовувати для лікування цукрового діабету і хвороби Паркінсона.

Але більшість захворювань, пов’язаних з пошкодженням чи незворотнім порушенням функції клітин, все ж вимагають пересадки більших клітинних утворень – фрагментів тканин, частин органів або цілих органів.

Гіпотетично вирощувати органи для трансплантації з репрограмованих власних клітин пацієнта можливо, немає тільки технології. І взаємодії між клітинами і тканинами у розвитку настільки складні, що відтворення цих процесів in vitro навряд чи можна назвати доцільним.

Міжвидова комплементація бластоцист in vivo для трансплантації
Зліва направо – звичайна миша, миша з клітинами щура, щур з клітинами миші, звичайний щур
Міжвидова комплементація бластоцист in vivo для трансплантації
Імплантація бластоцист

Вчені з Університету Токіо (University of Tokyo) під керівництвом професора Хіромітсу Накаучі (Hiromitsu Nakauchi) запропонували метод отримання органів in vivo, використовуючи технологію комплементації мутантних бластоцист.

Деякі мутації порушують взаємодію між ембріональними закладками і блокують розвиток окремих органів. При цьому клітини не можуть закінчити диференціювання і заповнити «нішу розвитку» того чи іншого органу.

Якщо в гомозиготну бластоцисту з такою мутацією ввести за допомогою ін’єкції плюрипотентні (індуковані або ембріональні) стовбурові клітини (ПСК) з нормальним генотипом, то ці клітини включаться в розвиток і заповнять порожню нішу. Утвориться орган, який складатиметься практично тільки з клітин-нащадків ін’єктованих ПСК. Якщо для комплементації використовувати пацієнт-специфічні індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (іПСК), можна отримати повністю сумісний сінгенний матеріал для трансплантації.

Як модель для доказу принципової можливості отримання органів з іПСК in vivo вчені використовували лінію мишей з мутацією за геном Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox 1). Транскрипційний фактор Pdx1 регулює в ембріогенезі взаємодія панкреатичного епітелію і мезенхіми – ключовий етап у ініціації розвитку підшлункової залози. При гомозиготній недостатності по гену Pdx1 підшлункова залоза не розвивається, тварини гинуть в перший тиждень після народження.

Міжвидова комплементація бластоцист in vivo для трансплантації
PDX1

Вчені отримали мутантні Pdx1-/- ембріони миші на стадії 8 клітин і за допомогою ін’єкції ввели в них EGFP марковані іПСК миші з генотипом Pdx1 +/+. Після цього химерні ембріони помістили в матку сурогатної матері, де вони імплантувалися і надалі нормально розвивалися. Новонароджені мишенята мали підшлункову залозу, епітелій якої цілком складався з EGFP+ Pdx1 +/+ клітин.

Ін’єктовані іПСК внесли свій вплив на екзокринні і ендокринні тканини підшлункової залози, включаючи епітелій протоків, при цьому стромальні елементи (судини, нерви і фіброцити сполучної тканини) мали змішане походження.

Більшість органів також мали змішане походження. Химерні миші доживали до дорослого стану (n = 15). Їх підшлункові залози виділяли інсулін у відповідь на введення глюкози, тварини підтримували нормальний рівень глюкози в крові.

Підшлункова залоза, яка походить від ін’єктованих EGFP + іПСК, придатна для трансплантації. Вчені пересадили острівці Лангерганса (скупчення ендокринних клітин, переважно в хвості підшлункової залози) з такої залози мишам ідентичного генотипу з експериментально індукованим діабетом.

Два місяці по тому клітини EGFP+ можна було спостерігати в місці трансплантації, де вони продукували інсулін, що було підтверджено імуногістохімічним фарбуванням. Тварини придбали здатність підтримувати нормальний рівень глюкози в крові.

Ці результати показують, що в процесі внутрішньовидової комплементації мутантної бластоцисти вільна «панкреатична ніша» у мишей Pdx1 -/- може бути заповнена нащадками ін’єктованих іПСК, що дає функціонально інтактну підшлункову залозу.

Міжвидова комплементація бластоцист in vivo для трансплантації
Мікрофотографія зрізу бета-клітини щура, яка була оброблена за допомогою модифікованої технології візуалізації НАСА

Другим кроком у дослідженнях стало отримання міжвидових химер миші та щура. Користуючись розробленими методами, вчені отримали автентичні іПСК пацюка і разом з аналогічними клітинами миші створили міжвидові химери в обох напрямках: вчені ін’єктували EGFP + іПСК миші в бластоцисти щура і помістили химерні бластоцисти в матку пацюка; аналогічно, EGFP + іПСК пацюка ін’єктували в бластоцисти миші, які потім перенесли в матку миші.

Міжвидова комплементація бластоцист in vivo для трансплантації
Бета-клітини в острівці підшлункової залози людини, імуногістохімічне фарбування, антитіла до інсуліну

Химерні ембріони успішно імплантувалися і розвивалися. Ксеногенні клітини EGFP+ включалися в розвиток всіх тканин плоду, але були відсутні в плаценті. Частота клітин EGFP+ варіювала між тканинами химер. Щоб точно виміряти рівень химеризма, дослідники провели генотипування субклонів первинних культур ембріональних фібробластів, а також колоній, утворених гемопоетичними стовбуровими клітинами крові. У обох типів міжвидових химер рівень химеризма як в фібробластах, так і в клітинах крові склав близько 26 – 28%.

Особини з більш високим химеризмом були відсутні, можливо гинули на ранніх стадіях розвитку. До статевої зрілості дожило близько 20% особин, тоді як у внутрішньовидових химер цей показник становить близько 50%. Швидкість ембріонального розвитку у міжвидових химер була нижчою, ніж у внутрішньовидових.

Таким чином, отримання ін’єкційних химер між мишею і щуром можливе в обох напрямках, але процес менш ефективний, ніж отримання внутрішньовидових химер. За розмірами тіла і видоспецифічними рисами органогенезу міжвидові химери були єдині з організмом сурогатної матері. Так пацюки та химери, розвиток яких відбувся в організмі щура, не мають жовчного міхура (n = 8), тоді як у мишей і химер, які розвивалися в організмі миші, він присутній (n = 4).

Мабуть фенотип міжвидових химер визначається за безпосередньою дією організму матері і часткою клітин кожного виду. Хоча у отриманих міжвидових химер майже всі органи були химерними, в сім’яниках дорослих особин, а також в гонадах ембріонів (грецькою Gonao – «породжую статеві залози, органи») ніколи не спостерігалося спільної експресії EGFP і мишачого гомолога білка Vasa – маркера клітин статевого шляху.

Іншими словами, нащадки ін’єктованих ПСК в ксеногенних умовах не вносили свій вклад в розвиток статевої лінії химер. У той же час ці лінії плюрипотентних клітин вдало включалися в статевий цикл внутрішньовидових химер, можливо через відмінності в регуляції розвитку статевих клітин у мишей та щурів. Кінцевою же метою досліджень було отримання ксеногенної підшлункової залози щура в організмі миші Pdx1 -/-.

Вчені ін’єктували іПСК пацюка в 139 мутантних ембріонів мишей, які потім перенесли в матки мишей. В результаті народилися 34 химерні тварини. Міжвидові химери з генотипом мишачих клітин Pdx1 -/- рідко доживали до статевої зрілості, однак при цьому дорослі особини мали інтактну підшлункову залозу з середньою часткою клітин EGFP+ щура 81,9 ± 3,4% (n = 2).

Імунне фарбування тканинних зрізів підшлункової залози показало експресію α амілази (маркер екзокринної тканини підшлункової залози), а також інсуліну, глюкагону і соматостатину (маркери ендокринної тканини підшлункової залози). Тварини були здатні підтримувати нормальний рівень глюкози в крові.

Експеримент показав, що утворення ксеногенного органу з іПСК в процесі міжвидової комплементації бластоцист є можливим. Описана система «вирощування» органів in vivo в майбутньому може бути застосована для отримання матеріалу для алло- і аутотрансплантації людини. Тваринами для подібних маніпуляцій можуть слугувати міні-свині. Однак щоб сьогодні застосувати технологію в клініці, треба ще подолати ряд труднощів. Отримання життєздатних міжвидових химер поки що є можливим тільки між невеликою часткою деяких видів ссавців. Необхідні для правильного розвитку взаємодії між клітинами у різних видів не збігаються, що позначається на виживанні і швидкості розвитку химер.

Так для химер миші і щура характерною є висока ембріональна смертність і летальні дефекти постнатального розвитку. Слід очікувати, що подібні проблеми проявляться при спробах створення химер людини і свині, якщо це взагалі буде можливо. Крім того, отримання міжвидових химер людини і свині, у яких всі органи, включаючи мозок і гонади, будуть химерними, наштовхується на явні етичні труднощі.

Виходом стало б використання комітованих стовбурових клітин замість ПСК. Якщо на певній стадії розвитку вводити комітовані клітини в певне місце ембріона, можливо тоді вдасться досягти їх спрямованого диференціювання в конкретний орган, тобто отримати тварин, у яких тільки деякі органи будуть химерними. Можливо, що при цьому знизиться і число дефектів розвитку.

При пересадці такого органу (підшлункової залози щура, отриманої в організмі миші шляхом заповнення порожньої «ніші розвитку») миші або пацюку неминуче відбудеться ксенотрансплантація з багатьма її небажаними особливостями, наприклад, необхідністю довічного придушення імунітету. Актуальним буде й використання розробленої технології комплементації мутантних організмів для отримання не цілих органів, а клітинного матеріалу для трансплантації. Отримання інсулін-продукуючих клітин з ПСК на сьогодні вимагає використання складного покрокового протоколу ендодермального in vitro диференціювання.

Цей метод потребує подальшого удосконалення в частині ефективності диференціювання, рівня продукції інсуліну і швидкості інсулінової відповіді на зміну концентрації глюкози в середовищі. Крім того, зберігається ризик розвитку пухлин через контамінацію клітинних препаратів недиференційованими або не повністю диференційованими ПСК. У той же час клітини, що продукують інсулін, отримані з підшлункових залоз, які виростили in vivo із застосуванням технології комплементації бластоцисти, повинні мати процеси диференціювання і правильні епігенетичні модифікації генома.

Be the first to comment

Leave a Reply

Your email address will not be published.


*