Зоолог Август Вейсман у праці «Нариси про спадковість та споріднені біологічні проблеми» (Essays upon Heredity and Kindred Biological Problems), опублікованій у 1889 році, одним із перших спробував науково пояснити походження старіння та смерті.
А. Вейсман вважав старість результатом еволюції: «…нестаріючі організми не тільки не є корисними, але й шкідливі, оскільки займають місце молодих». Саме тому, на його думку, еволюція приводить живі організми до старіння.
Ідею старіння як результату еволюції розвинув і значною мірою переосмислив англійський біолог Пітер Медавар (Sir Peter Brian Medawar) у 1951 році у доповіді перед Лондонським королівським товариством «Невирішена проблема в біології» (An Unresolved Problem in Biology). Він зазначив, що тварини в природі рідко доживають до старості, тому природний добір не може безпосередньо формувати процес старіння.
У 1960 році Медавар спільно з австралійським вірусологом Френком Макфарлейном Бернетом (Sir Frank Macfarlane Burnet) отримав Нобелівську премію з фізіології та медицини «За відкриття штучної імунної толерантності». Однак конкретного пояснення причин старіння вони не дали. Мало що прояснила і розшифровка структури ДНК у 1953 році — вона лише поставила перед ученими ще більше запитань із багатьма невідомими.
За відкриття молекулярної структури ДНК у 1962 році британському біологу Френсісу Крику (Francis Crick), американському біологу Джеймсу Вотсону (James Dewey Watson) і британо-новозеландському вченому Морісу Вілкінсу (Maurice Hugh Frederick Wilkins) була присуджена Нобелівська премія з фізіології та медицини.
У ті роки вчені схилялися до думки, що людська клітина здатна до проліферації в організмі й може нескінченно довго відтворюватися в культурі. Якби це було насправді, то це означало б, що люди старіють і вмирають не відповідно до програми клітинної деградації, а внаслідок позаклітинних процесів, що відбуваються на вищому фізіологічному рівні (Квітко О. В., Конєва І. І. та співавт., 2000).
Лише згодом учені почали формувати більш-менш узгоджені погляди на теорію старіння. У 1961 році американський учений Леонард Хейфлік (Leonard Hayflick), професор анатомії Каліфорнійського університету (University of California) у Сан-Франциско, виявив, що навіть в ідеальних умовах клітина здатна ділитися лише обмежену кількість разів. При наближенні до кінця цього ліміту в клітині проявляються ознаки старіння (Hayflick L., Moorhead P. S., 1961).
Ліміт поділів встановлено практично для клітин усіх багатоклітинних організмів. Максимальна кількість поділів залежить від типу клітини та організму. Було з’ясовано, що для більшості людських клітин ця межа становить близько 50 поділів. Також виявили, що зі збільшенням віку донора кількість поділів значно зменшується.
Тобто в організмі будь-якої живої істоти є щось на кшталт «біологічного годинника» — лічильника поділів, який встановлює ліміт на загальну кількість поділів клітини (Hayflick L., 1998). Цю межу названо лімітом Хейфліка.
Як працює цей «лічильник»? У 1971 році радянський учений Олексій Оловников на підставі даних про принципи синтезу ДНК у клітинах запропонував теорію маргінотомії (the theory of marginotomy), яка пояснювала механізм роботи такого «лічильника». На думку Оловникова, під час матричного синтезу полінуклеотидів ДНК-полімераза не здатна повністю відтворити лінійну матрицю: новосинтезована копія завжди виходить коротшою за початкову матрицю. Таким чином, під час кожного поділу клітини кінцеві ділянки ДНК коротшають, що обмежує проліферативний потенціал клітин і, очевидно, є тим самим «лічильником» кількості поділів клітини (Оловников О. М., 1971).
Наприкінці 1980-х років серією відкриттів учених Елізабет Блекберн (Elizabeth H. Blackburn), Джека Шостака (Jack W. Szostak) і Керол Грейдер (Carol W. Greider) було підтверджено гіпотезу Оловникова. Саме ці троє вчених у 2009 році були удостоєні Нобелівської премії з фізіології або медицини. Їм вдалося з’ясувати механізм, завдяки якому хромосоми під час поділу клітини копіюються повністю, тобто якимось чином захищаються від деградації.
Рішення знайшли на кінцях хромосом — це теломери (від грец. telos — кінець і meros — частина; назву запропонував Герман Джозеф Меллер у 1932 році), а також фермент, який формує теломери, — теломераза. Довгі спіралі молекул ДНК, що несуть генетичну інформацію, «упаковані» в хромосоми, на кінцях яких знаходяться теломери — «захисні ковпачки».
Е. Блекберн і Дж. Шостак виявили, що унікальна послідовність ДНК, яка міститься в хромосомах, захищена від деградації за допомогою теломер. К. Грейдер і Е. Блекберн також відкрили теломеразу, яка добудовує кінцеві ділянки хромосом, що коротшають під час чергового поділу клітини.
Було встановлено, що чим коротша теломера, тим старіша клітина. І навпаки: якщо активність теломерази висока, підтримується довжина теломер, клітина може довше зберігати здатність до поділу, але водночас зростає ризик розвитку ракових клітин, які також прагнуть безсмертя. Певні спадкові захворювання характеризуються наявністю дефектної теломерази, що призводить до передчасного старіння клітин. Теломери містять повторювані послідовності ДНК і захищають генетичний матеріал хромосом.
Ще в 1930-ті роки американський генетик Герман Джозеф Меллер (Hermann Joseph Muller), лауреат Нобелівської премії з фізіології та медицини 1946 року за відкриття індукованих рентгенівським опроміненням мутацій, а згодом Барбара Мак-Клінток (Barbara McClintock), лауреат Нобелівської премії з фізіології та медицини 1983 року за відкриття генетичної транспозиції, звернули увагу на структури на кінцях хромосом — теломери, які перешкоджають зчепленню хромосом між собою. Було припущено, що теломери виконують захисну роль, але механізм їхньої дії залишався загадкою.
У середині XX століття вчені зрозуміли, як відбувається копіювання генетичного матеріалу. Але виникла інша проблема: під час поділу клітини відбувається «розплітання» спіралі ДНК на два ланцюги та її копіювання ферментом ДНК-полімеразою.
Кінець одного з двох ланцюгів ДНК не може бути повністю скопійований ДНК-полімеразою, оскільки для синтезу дочірнього ланцюга необхідний праймер, а після його видалення на кінці молекули залишається незаповнена ділянка. Це призводить до поступового вкорочення кінцевих ділянок хромосом під час кожного циклу реплікації.
Логічно припустити, що внаслідок цього довжина хромосоми повинна зменшуватися щоразу, коли клітина ділиться. На ділі цього не відбувається завдяки теломерам. Нобелівські лауреати встановили, яким чином функціонують теломери, і виявили фермент теломеразу, яка підтримує їхню довжину.
На початку своєї кар’єри Е. Блекберн картувала послідовності ДНК, вивчаючи хромосоми прісноводної війчастої інфузорії роду Tetrahymena, деякі види якої часто використовують як модельні організми в біологічних і медичних дослідженнях. Учена виявила в хромосомах інфузорії повторювані послідовності ДНК, які можна записати у вигляді CCCCAA. Функція цієї послідовності була неясною.
Учений Дж. Шостак зробив спостереження, згідно з яким уведена в клітину дріжджів лінійна молекула ДНК, на зразок міні-хромосоми, швидко деградувала.
Обидва вчені зустрілися на конференції у 1980-х роках, де Е. Блекберн представляла результати своєї роботи. Обидва дослідники вирішили провести спільний експеримент, у якому мали бути подолані бар’єри між такими далекими організмами, як інфузорії та дріжджі. Отже, з ДНК інфузорії Tetrahymena Е. Блекберн ізолювала послідовність CCCCAA, а Дж. Шостак приєднав цю послідовність до міні-хромосоми, яку помістив у клітину дріжджів (див. рисунок).
Результати, опубліковані в 1982 році, виявилися вражаючими: послідовність CCCCAA ДНК теломер захищала міні-хромосоми від деградації. Оскільки ДНК теломер одного організму — інфузорії Tetrahymena — захищала хромосоми зовсім іншого організму — дріжджів, цей досвід продемонстрував існування раніше невідомого фундаментального механізму. Пізніше стало очевидно, що ДНК теломер із характерною для них послідовністю є у більшості рослин і тварин — від амеби до людини.
Фермент, що будує теломери. Після виявлення теломер необхідно було встановити механізм, за допомогою якого вони будуються на кінцях хромосом. К. Грейдер, яка працювала під керівництвом Е. Блекберн, проводила дослідження з метою з’ясувати, який невідомий фермент бере участь у формуванні ДНК теломер. На Різдво 1984 року К. Грейдер виявила ознаки ферментативної активності в клітинному екстракті.
Виявлений ензим Е. Блекберн і К. Грейдер назвали теломеразою. Після його виділення та очищення вчені встановили, що він складається не тільки з білка, а й із РНК, яка містить послідовність, комплементарну до ділянки теломери.
Отже, РНК служить шаблоном для побудови теломер, а білковий компонент теломерази необхідний безпосередньо для ферментативної діяльності. Теломераза подовжує теломерну ДНК, забезпечуючи платформу, яка, своєю чергою, дозволяє ДНК-полімеразі скопіювати хромосому без втрати генетичної інформації. Отже, під час копіювання хромосома не вкорочується критично.
Теломери проти старіння клітини. Тепер учені почали досліджувати, яку роль теломери виконують у клітині. Дж. Шостак зі співробітниками виявив, що в клітинах дріжджів із відповідними мутаціями теломери поступово коротшають. Такі клітини дуже погано ростуть, а потім і зовсім припиняють ділитися. Е. Блекберн зі співробітниками спостерігала подібну картину в інфузорії Tetrahymena, якщо РНК теломерази зазнавала мутацій. В обох випадках це призводило до передчасного клітинного старіння. І навпаки, теломери, які нормально функціонували, запобігали критичному вкороченню хромосом і затримували клітинне старіння.
Пізніше К. Грейдер зі співробітниками встановила, що подібний механізм працює і в клітинах людини, де вкороченню кінцевих ділянок хромосом перешкоджає теломераза. Завдяки проведенню інтенсивних досліджень у цій галузі тепер відомо, що послідовність ДНК у теломері притягує білки, які формують захисний «ковпачок» навколо тендітних кінців ДНК.
Укорочення теломер може бути пов’язане не тільки з клітинним старінням, а й із процесами старіння всього організму. Водночас більшість клітин не ділиться настільки часто, тому їхні хромосоми не зазнають значного ризику вкорочення, а такі клітини не потребують високої активності теломерази. І навпаки, ракові клітини мають здатність ділитися практично необмежено й уміють підтримувати необхідну довжину теломер за рахунок високої активності теломерази. Тому розробляються методи лікування онкологічних та інших захворювань на основі інгібування активності теломерази (від лат. inhibere — затримувати, сповільнювати чи зупиняти).
Однак теломери, як з’ясувалося, можна розглядати не тільки в медико-біологічному аспекті, а й у соціально-економічному, а також з точки зору якості життя.
Е. Блекберн із колегами з Каліфорнійського університету в Сан-Франциско (University of California, San Francisco) у ході пілотного дослідження виявили, що матері, які доглядали за тяжкохворими дітьми, мали коротші теломери в період найвищого рівня емоційного стресу (today.ucsf.edu; Njajou O. T., Cawthon R. M., Damcott C. M., 2007).
Інше дослідження, опубліковане у 2006 році в журналі Aging Cell, яке проводив доктор Тім Спектор (Dr Tim Spector) із колегами з лондонського госпіталю St Thomas’s Hospital та New Jersey Medical School, показало, що люди з менш розвинених країн мають коротші теломери, ніж ті, хто живе в розвинених країнах (Cherkas L. F., Aviv A., Valdes A. M., 2006).
На сьогодні проводиться декілька клінічних випробувань, у яких оцінюється ефективність лікарських засобів, механізм дії яких спрямований на активність ферменту теломерази.
Американська компанія Geron Corporation проводила за участю людей клінічні випробування препаратів, які мають інгібувальні властивості щодо теломерази, а також дослідження можливості імунізації людини вакциною, яка сприяла б виробленню антитіл до клітин із гіперактивною теломеразою.
Американська компанія Merck & Co. отримала від Geron ліцензійні права на подання заявки на досліджуваний лікарський засіб (Investigational New Drug, IND) для ще однієї схожої вакцини. Платформа для створення подібних вакцин проходила тестування спільно з Merck & Co. за трьома напрямами:
1. розглядалася вакцина на основі аденовірусної плазміди;
2. здійснювалася спроба створення вакцини на основі аутологічних дендритних клітин (autologous dendritic cell-based vaccine) під назвою GRNVAC1 (раніше — TVAX), яка у I фазі клінічних досліджень при раку простати продемонструвала значне посилення Т-клітинної відповіді;
3. створювалася вакцина на основі похідних дендритних клітин, отриманих з ембріональних стовбурових клітин, розроблена компанією Geron.
Ці методи вакцинації спрямовані на те, щоб імунна система людини сама навчилася атакувати ракові клітини, які експресують теломеразу. Наступний підхід у розробленні лікарських засобів — створення інгібіторів теломерази. Дія препарату GRN163L, розробленого компанією Geron, була спрямована на те, щоб зупинити поширення ракової пухлини шляхом зв’язування теломерази.
Незважаючи на те, що in vitro дійсно вдавалося домогтися загибелі популяції ракових клітин, існує ALT-механізм (від англ. Alternative Lengthening of Telomeres — альтернативне подовження теломер), що ускладнює ефективність такої терапії (Bryan T. M., Englezou A., Gupta J., 1995; Henson J. D., Neumann A. A., Yeager T. R., 2002). Однак Geron заявляла, що препарат із групи інгібіторів теломерази GRN163L, викликаючи загибель ракових стовбурових клітин, продемонстрував високу ефективність. Він безпосередньо зв’язується з РНК-матрицею теломерази, тим самим блокуючи подальший синтез теломер. При цьому вчені зазначали, що навіть мутація РНК-матриці теломерази не здатна повернути їй активність.
Такий підхід спрямований саме на інгібування РНК-матриці ферменту. На думку Е. Блекберн, це був багатообіцяльний лікарський засіб майбутнього не тільки для лікування ракових пухлин. Інгібітори теломерази можуть допомогти подолати деякі спадкові хвороби, які, як стало відомо, виникають через дефектну теломеразу, включаючи певні форми вродженої апластичної анемії — захворювання, при якому пригнічується або повністю припиняється утворення та дозрівання всіх трьох клітинних ліній у кістковому мозку.
Деякі спадкові дерматологічні та легеневі захворювання також спричинені дефектами теломерази. Але інтерес до інгібіторів та активності теломерази все ж залишає надію, що вчені спробують впливати на тривалість життя людини або хоча б на швидкість старіння.
Проведене у 2009 році дослідження активності теломерази у євреїв-ашкеназі показало, що довгожителі мають гіперактивну теломеразу. Так, починаючи з 2001 року, було виявлено декілька сполук, які активували вироблення цього ферменту. Першою була каліфорнійська компанія Geron, яка досліджувала речовину TA-65, яку вчені виділили з рослини астрагалу (Astragalus propinquus).
Ця речовина продемонструвала здатність активувати теломеразу. У квітні 2007 року Geron передала права на дослідження нью-йоркській компанії Telomerase Activation Sciences Inc. (TA Sciences).
У листопаді 2007 року американська компанія Sierra Sciences LLC також заявила, що виявила речовину C0057684, яка сприяє активності теломерази в соматичних клітинах; у 2009 році ця ж компанія оголосила про відкриття ще 62 сполук із подібними властивостями (Tanglao, Shawna et al., 2008).
Відкриття Е. Блекберн, К. Грейдер і Дж. Шостака сприяли формуванню нового розуміння процесів поділу клітини, допомогли дослідити механізми розвитку захворювань і стимулювали розроблення потенційно нових терапевтичних методів, про ймовірне практичне застосування яких ще не раз писатимуть. Джерело